Introduction
干腌肉品因其独特风味而成为许多国家和地区颇受欢迎的传统食品，风味是一项重要的品质参数，也是影响消费者接受程度的重要因素。干腌肉品风味由非挥发性风味物质（肽、游离氨基酸、有机酸、核苷酸等）和挥发性风味物质（醇、醛、酮、酸、酯等）共同决定。
以往的研究表明，强烈的蛋白质水解会影响干腌肉品的风味。在干腌肉品加工过程中，内源蛋白酶（如钙蛋白酶、组织蛋白酶、二肽酶和氨肽酶）是影响蛋白水解的关键因素之一。肌原纤维蛋白（尤其是肌球蛋白-2）是味觉活性氨基酸的良好前体。肌肉蛋白质可被钙蛋白酶和组织蛋白酶水解为肽和蛋白质片段，然后继续被二肽酶和氨肽酶水解，产生小肽和游离氨基酸（FAAs）。小肽和FAAs是干腌肉品主要的滋味物质。此外，小肽和FAAs还是支链醇、硫化物和杂环化合物（含氮或氧和脂肪族基团）等挥发性风味物质的前体，目前，人们一直在努力研究不同干腌肉品的滋味物质和挥发性物质的特征，并初步阐明挥发性物质前体和挥发性物质之间的潜在关系。然而，内源蛋白酶与关键风味物质之间的潜在关系仍有待阐明。
本研究旨在描述干腌脖肉加工过程中内源蛋白酶活性、FAAs和挥发性物质的动态变化；初步筛选关键风味物质，并进一步探讨其与内源蛋白酶的关系，这将有助于更好地了解风味的形成。
Results and Discussion
钙蛋白酶活性仅在S1、S2和S3被检测到，而在随后的熟化阶段失去活性。组织蛋白酶活性一直持续到加工结束。在S7时，组织蛋白酶B、L、H和D的残余活性分别为61.38%、74.14%、32.15%和58.49%。DPP Ⅰ在整个过程中保持高活性，S7时的残余活性分别是DPP Ⅱ、DPP Ⅲ和DPP Ⅳ的3.5、18.1和2.4倍。DPP Ⅱ和DPP Ⅲ活性的波动范围分别为0.009～0.020 U/g pro和0.004～0.012 U/g pro。DPP Ⅳ活性在S2阶段迅速降低了87%，在随后的干燥和熟化阶段仍保持较低的残余活性。氨肽酶中AAP的活性最高；从S1到S4，AAP和RAP活性保持稳定，然后逐渐降低；LAP和MAP活性在S2增加，然后开始下降。
图1 干腌脖肉加工过程中内源蛋白酶活性变化
图2 干腌脖肉加工过程中蛋白水解
鲜肉中FAAs含量为179 mg/100 g，而S7样品中的FAAs含量增至582.21 mg/100 g。在S7时，必需氨基酸含量为222.17 mg/100 g，占总游离氨基酸的38.16%。Lys、Val和Leu是终产品中主要的必需氨基酸。与鲜肉相比，终产品中的甜味、苦味、鲜味和酸味氨基酸含量明显增加。为进一步评估FAAs对干腌脖肉滋味的影响，对其TAV进行了评价。在终产品中，Glu、Lys、Val、Ala和Leu的TAV分别为3.26、1.29、1.17、1.10和1.06，这表明它们对干腌脖肉的滋味有重要贡献。其中，Glu、Leu和Val分别呈现出鲜味/酸味、苦味和苦味/甜味，其余的则是甜味。
图3 干腌脖肉加工过程中挥发性化合物
在干腌脖肉加工过程中，共鉴定出47种挥发性化合物，包括醛类（14）、酸类（9）、酯类（7）、烷类（3）、酮类（3）、醇类（2）、酚类（2）和其他化合物（7）。为进一步评估挥发性物质对干腌脖肉风味的贡献，本研究对挥发性化合物的VIP值进行了评估。在干腌脖肉加工过程共获得25种VIP值大于1的挥发性化合物，而在终产品中仅检测到18种。因此，己醛、壬醛、辛醛、苯甲醛、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸和辛酸乙酯等18种挥发性化合物确定为干腌脖肉的关键挥发性化合物。
图4 干腌脖肉加工过程中内源蛋白酶与关键风味物质的偏相关分析
图5 预测的内源蛋白酶影响关键风味物质形成的潜在途径
为研究内源蛋白酶对干腌脖肉中关键风味物质形成的影响，本研究采用偏相关分析进一步分析内源蛋白酶与关键风味物质之间的潜在关系。Glu与组织蛋白酶L、DPP Ⅰ和氨肽酶呈显著负相关（P＜0.001），而与组织蛋白酶H和DPP Ⅲ负相关性较弱（P＜0.01）。Glu与DPP Ⅱ呈正相关关系（P＜0.05）。Leu和Val与组织蛋白酶B、DPP Ⅳ和RAP均具有负相关性（P＜0.05）。Ala和Lys分别与AAP和RAP呈显著负相关（P＜0.05）。
在醛类中，RAP与己醛负相关最为显著（P＜0.001），其次是壬醛（P＜0.01）。相比之下，组织蛋白酶B和D、DPP Ⅱ和DPP Ⅳ与己醛相关性较弱（P＜0.05）。辛醛、苯甲醛和2,4-十二烯醛与组织蛋白酶H呈负相关（P＜0.05）。在酸类中，乙酸和辛酸与DPP Ⅳ和AAP也呈负相关性（P＜0.05）。这些影响可能是由于内源蛋白酶调节美拉德反应底物的积累（如Lys、His、Phe、Tyr、Trp和Cys等）。Lys和His可与葡萄糖、乙醇反应生成己醛、壬醛、辛醛和苯甲醛。此外，Phe、Tyr和Trp也可以通过一系列复杂的生化反应转化为乙醇和乙酸，这可能为上述反应提供底物。Cys和谷胱甘肽可以与2,4-十二烯醛反应生成己醛。2-甲基丙酸和3-甲基丁酸与组织蛋白酶L、DPP Ⅰ、DPP Ⅱ、DPP Ⅲ、AAP和RAP的活性密切相关（P＜0.05）。Val和Ile通过Strecker降解转化为2-甲基丙醛和3-甲基丁醛，可进一步氧化为2-甲基丙酸和3-甲基丁酸。因此，AAP和RAP可能通过调节Val和Ile的形成去影响2-甲基丙酸和3-甲基丁酸的积累。在酯类方面，癸酸乙酯和辛酸乙酯与组织蛋白酶L、AAP、LAP和RAP是负相关（P＜0.05），而与DPP Ⅱ呈正相关（P＜0.01）。酸和醇可通过酯化反应可形成酯。因此，DPP Ⅰ、AAP和RAP可能通过调节辛酸的形成去实现对辛酸乙酯积累的调控。2,3-戊二酮与DPP Ⅳ、AAP、RAP是负相关性（P＜0.05），而2,3-辛二酮与DPP Ⅰ、AAP、RAP之间存在负相关的关系（P＜0.05）。前人研究揭示Leu与酮类含量相关，根据本研究结果推断DPP Ⅳ和RAP共调控Leu积累，去影响酮类物质的形成与积累。
Conclusion
Glu、Lys、Val、Ala 和 Leu 是关键的味觉活性氨基酸，它们赋予干腌脖肉鲜味、酸味、苦味和甜味。共确定18种关键挥发性化合物，如己醛、壬醛、辛醛、苯甲醛、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸和辛酸乙酯等。对内源蛋白酶和关键风味物质之间的潜在关系进行评估。结果表明，内源蛋白酶对关键物质的积累有显著影响，如 组织蛋白酶B和D、DPP Ⅳ和RAP对Lys有很大影响。同时，它们还对己醛积累有强烈影响，这可能是通过调节Lys等FAAs的积累实现的。RAP不仅显著影响关键味觉活性氨基酸的积累，还影响辛酸乙酯、2,3-戊二酮和2,3-辛二酮的积累，这可能是通过调节辛酸和Leu的积累实现的。这项工作丰富了内源蛋白酶与关键风味物质之间潜在关系的信息，为通过内源蛋白酶调控改善干腌肉品风味奠定了基础。
第一作者
李明明，贵州大学酿酒与食品工程学院硕士研究生，中国肉类食品综合研究中心联合培养硕士研究生。主要研究方向为食品风味物质及生物活性肽。近年来，以第一作者在国际主流学术期刊上发表SCI论文3篇。
通信作者
朱秋劲，教授，博士生导师，2007年获得江南大学食品营养与安全专业博士学位。现任贵州大学酿酒与食品工程学院副院长，Food Science of Animal Products编委、《肉类研究》科学副主编，《乳业科学与技术》等学术期刊编委，《食品科学》、Food Chemistry、Foods等期刊审稿专家。贵州省第三批百层次人才项目获得者，贵州省第八批省管专家，贵州省生态特色肉制品科技创新人才团队领衔人。目前的研究方向有畜产品加工与贮藏工程、食品营养与安全、微生物学。组建了一支以畜产食品加工、营养、安全相互交融的技术研发团队。主持国家自然科学基金项目4 项，承担省科技项目共10余项；参与国家级、省部级纵向项目近20 项；主持和参与各种横向合作项目20余项。发表学术论文200余篇，其中英文SCI 论文30余篇，主持和参与编制地方标准4 项，团体标准1项；主编和副主编著作各1 部，参编教材4 部，参编著作1 部；主持获贵州省科技进步三等奖2 项，省级优秀论文三等奖2 项，黔东南州科技合作奖1 项，贵州省农业丰收二等奖1 项；获得国家发明授权专利和转让的发明专利共10 件，澳大利亚革新专利1 件。
张欣，博士，高级工程师，现就职于北京食品科学研究院酿造科学与工程研究部，从事食品微生物与酶学研究，在传统酿造食品、西式发酵食品、生物活性物质研究等方面取得多项成果。主持或参加“十三五”国家重点研发计划、国家自然科学基金、工程院战略咨询项目等10余项。累计发表科技论文20余篇，参与制定国际标准1项。
Elucidation of potential relationship between endogenous proteases and key flavor substances in dry-cured pork coppa
Mingming Li
a,b
, Qiujin Zhu
b,*
, Chao Qu
a,c
, Xiaohui Gong
b
, Yunhan Zhang
a
, Xin Zhang
a,c,*
, Shouwei Wang
a,c
a
b
c
*Corresponding author.
Abstract
Dry-cured meat products are considerably popular around the world due to unique flavor. Proteolysis is one of the enzymatic reactions from which flavor substances are derived, which is affected by endogenous proteases. The purpose aimed to reveal the potential relationship between endogenous proteases and key flavor substances in dry-cured pork coppa in this paper. The dynamic changes of endogenous proteases activity, free amino acids, and volatiles during dry-cured pork coppa processing were characterized. The results showed that 5 kinds of free amino acids, Glu, Lys, Val, Ala, and Leu, were identified as significant contributors to taste. Meanwhile, key volatiles, such as hexanal, nonanal, octanal, benzaldehyde, 3-methyl butanoic acid, 2-methyl propanoic acid, and ethyl octanoate, greatly contributed to the flavor characteristics of dry-cured pork coppa. Further partial correlation analysis was performed to better elucidate the relationship among parameters. The results revealed that close relationship between endogenous proteases and key substances. RAP not only significantly affected the accumulation of key active-amino acids, but also affected the accumulation of ethyl octanoate, 2,3-pentanedione, and 2,3-octanedione by regulating the accumulation of octanoic acid and Leu. In addition, cathepsin B and D, DPP Ⅱ, DPP Ⅳ and RAP notably affected accumulation of hexanal.
Reference:
LI M M, ZHU Q J, QU C, et al. Elucidation of potential relationship between endogenous proteases and key flavor substances in dry-cured pork coppa[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 2152-2160. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250179.
