广东生态工程职业学院胡瑾、谢梅英博士等：罗伊氏乳杆菌抑制肠上皮_

哺乳动物肠炎是由循环系统中的促炎症细胞因子水平升高，引起机体剧烈的炎症反应。肠上皮细胞作为肠道黏膜的重要组成，能够阻断肠道微生物进入人体内，在肠道免疫功能中扮演着重要角色。罗伊氏乳杆菌是一种天然的益生菌，定殖在许多哺乳动物的胃肠道中，对宿主的健康发挥重要的调节作用。

微小核糖核酸拟探究罗伊氏乳杆菌是否通过改变宿主miRNAs表达调控肠上皮细胞炎症反应和凋亡及其相关调控机制。（miRNAs）是目前研究最多的一种非编码小RNA，其作用的机制是通过抑制mRNA的翻译或降解mRNA调节基因表达，在个体生长、发育、免疫、代谢等多种生物进程中发挥作用，对人类疾病治疗有重要意义。研究表明，miRNA也与肠道微生物群-宿主的相互作用密切相关。

广东生态工程职业学院的陈鹏、胡瑾*、谢梅英*等ELISA实验结果表明，与对照组相比，LPS处理后肠上皮细胞促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌显著增加，罗伊氏乳杆菌和LPS共处理后，罗伊氏乳杆菌抑制了肠上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌（图1A）。免疫荧光染色结果表明，与对照组相比，LPS处理的肠上皮细胞中细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达显著上调，罗伊氏乳杆菌显著抑制LPS引起的肠上皮细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达的上调（图1B、C）。上述结果表明罗伊氏乳杆菌能够阻断肠上皮细胞炎症反应和凋亡。

1 罗伊氏乳杆菌对肠上皮细胞炎症反应和细胞凋亡的影响

2 罗伊氏乳杆菌和miR-196a对通过肠上皮细胞炎症反应和凋亡的影响

由图2A可知，与小鼠肠上皮细胞相比，LPS诱导细胞炎症反应后，miR-196a水平降低82.14%（变化程度排名第2）；罗伊氏乳杆菌和LPS共处理后，其细胞miR-196a水平较LPS处理细胞中miR-196a水平上调16.5 倍（变化程度排名第1），GEO测序数据和定量分析结果均表明miR-196a在此过程中变化最为显著，miR-196a可能在LPS引起的肠上皮细胞炎症反应、细胞凋亡和罗伊氏乳杆菌缓解LPS毒性过程中均发挥重要调控作用，且miR-196a在肠上皮细胞炎症反应和凋亡中的功能鲜有报道。因此，利用罗伊氏乳杆菌和LPS共同处理抑制肠上皮细胞中miR-196a的表达（图2B），结果表明干扰miR-196a表达后，罗伊氏乳杆菌抑制LPS引起的肠上皮细胞凋亡和炎症反应的作用消失（图2C～E），表明罗伊氏乳杆菌可能通过上调肠上皮细胞中miR-196a的表达，抑制细胞炎症反应和凋亡。

3 miR-196a靶基因的筛选与验证

为进一步解析miR-196a肠上皮细胞炎症反应和凋亡的分子机制，本研究通过TargetScan网站对miR-196a的靶基因进行分析预测，并与LPS诱导肠上皮细胞炎症和凋亡模型的转录组测序数据比对，发现miR-196a与PDCD4可能存在靶向结合（图3A），且PDCD4在LPS诱导炎症反应的肠上皮细胞中表达上调，罗伊氏乳杆菌和LPS共处理抑制LPS引起的PDCD4表达上调（图3B）。使用RNAhybrid 2.2在线网站分析miR-196a与PDCD43′UTR结合自由能情况，结果显示二者的结合自由能较低（图3C），miR-196a与PDCD4可能存在靶向结合。在肠上皮细胞中过表达miR-196a，可减少PDCD4 mRNA和蛋白含量；与之相反，在干扰miR-196a表达的肠上皮细胞中，PDCD4 mRNA和蛋白水平上调（图3D、F）。此外，在293T细胞中开展的双荧光素酶报告基因结果表明，miR-196a显著抑制包涵PDCD4野生型3′UTR的pmirGLO载体荧光素酶活性，但对包涵PDCD4突变型3′UTR的pmirGLO载体荧光素酶活性无影响（图3G）。上述结果表明miR-196a靶向抑制PDCD4表达。

4 miR-196a及其靶基因PDCD4对肠上皮细胞炎症反应和凋亡的影响

为验证miR-196a是否通过靶向PDCD4抑制肠上皮细胞炎症反应和凋亡，在过表达miR-196a的肠上皮细胞中观察过表达PDCD4对肠上皮细胞炎症反应和凋亡的影响。ELISA结果表明，与LPS处理组相比，miR-196a过表达显著抑制LPS诱导肠上皮细胞炎症因子分泌；而过表达PDCD4后逆转了miR-196a对肠上皮细胞炎症因子分泌的抑制作用（图4A）。进一步的免疫荧光实验结果表明，与LPS处理组相比，miR-196a过表达后显著抑制肠上皮细胞中细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达，PDCD4的过表达消除miR-196a对Caspase-3表达的抑制作用（图4B、C）。

讨论与结论

肠道不仅是人体消化、吸收、营养物质转运的主要器官，也是体内最大的免疫器官和“细菌库”，位于连接机体内外环境的核心位置，对维持人体健康生长具有重要作用。肠道黏膜作为机体免疫的第一道防线，在抵抗天然毒素、肠道共生菌群和入侵的病原体引起的肠道炎症反应中扮演着重要角色。肠炎是一种肠黏膜免疫系统紊乱性疾病，由遗传因素、上皮屏障受损、肠道菌群失调等因素相互作用导致。虽然，抗生素等药物治疗可缓解肠炎，但由于抗生素治疗容易导致细菌产生耐药性，所以肠炎极易复发。因此，探究肠炎的发生发展机制、开发利用高效无副作用的生物制剂，对于防治肠炎具有紧迫的研究意义。

肠道微生物群被认为是调节宿主健康的关键因素之一。益生菌是一种对宿主健康有益的微生物，它通过调节肠道微生物区系和肠道免疫等方式抑制病原微生物对肠道健康的损害。Kim等研究表明，短乳杆菌KU15152对HT-29细胞有较强的黏附力，其通过调节丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶和糖原合酶激酶抑制核因子-κB的活化，从而减轻金黄色葡萄球菌脂磷壁酸诱导的肠道炎症反应。戊糖片球菌ZY-B通过上调紧密连接蛋白的表达改善肠屏障功能障碍，并下调大麻素受体1和大麻素受体2表达，降低小鼠回肠、盲肠和结肠的副溶血性弧菌含量，从而防止结肠萎缩，增强黏膜完整性。此外，副益生菌嗜酸乳杆菌PIN7可通过调节TLR-6介导的免疫反应和肠道菌群组成，改善葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎。罗伊氏乳杆菌I5007最初从仔猪的结肠中分离出来，能够上调猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白和防御肽的表达，进而增强猪肠道免疫功能。同时，罗伊氏乳杆菌可以预防和治疗人肠道菌群紊乱引起的肠道不适，具有益生功能，但相关机制未明。本研究发现罗伊氏乳杆菌减轻LPS引起的肠上皮细胞凋亡和炎症反应，可开发为促进肠道健康的生物制剂。

miRNA是一种对哺乳动物细胞内基因转录翻译进行调控的非编码小RNA，尽管不直接编码蛋白质，但却通过对靶基因转录和翻译进行调控间接参与哺乳动物细胞的分化、增殖、转移及凋亡。前期研究发现，miR-196a在骨肉瘤细胞中表达上调，从而抑制骨肉瘤细胞凋亡，促进骨肉瘤细胞的增殖及成瘤能力；此外，miR-196a通过抑制RAN结合蛋白10表达改善神经元形态，为亨廷顿舞蹈症患者提供神经保护。本研究发现，LPS诱导肠上皮细胞凋亡和炎症反应过程中miR-196a表达下调，而罗伊氏乳杆菌通过增加细胞miR-196a含量抑制肠上皮细胞凋亡和炎症反应。

PDCD4是Shibahara等在诱导凋亡的鼠细胞中发现的具有MA-3功能域的新基因。PDCD4是进化上高度保守的基因，广泛表达于多种组织和器官，细胞凋亡和炎性疾病的发生密切相关。在心脏缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡过程中PDCD4基因表达升高，靶向抑制心肌细胞中PDCD4蛋白的表达，可显著减少心肌细胞凋亡；PDCD4蛋白在高浓度葡萄糖诱导凋亡的血管内皮细胞中表达上调，干扰PDCD4基因表达显著抑制血管内皮细胞的凋亡。此外，在肠缺血再灌注过程中，肠上皮细胞的炎症反应和凋亡是由于miR-21表达下调，其靶基因PDCD4表达增加导致。产气荚膜梭菌β2毒素感染肠上皮细胞后通过抑制miR-21上调PDCD4表达，从而诱导细胞凋亡和炎症反应；而在结直肠癌细胞中PDCD4基因表达降低，而miR-196a表达增加，miR-196a通过靶向PDCD4抑制结直肠癌细胞凋亡。这些研究表明靶向调控PDCD4表达可影响细胞凋亡。