研究介绍
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研究背景
Background
百日咳是一种由百日咳杆菌（Bordetella pertussis）引起的高度传染性呼吸道疾病，尽管许多国家的疫苗接种覆盖率很高，但它已经重新出现成为一个严重的公共卫生问题。除了对婴儿进行初级疫苗接种外，广泛使用含无细胞百日咳疫苗（aP）的增强剂疫苗，以增加对学龄前儿童、青少年和包括孕妇在内的成人的百日咳保护。百日咳增强疫苗配方中含有破伤风和白喉毒素（Tdap），有时还包括灭活的小儿麻痹症病毒（IPV）（Tdap-IPV），并诱导产生针对百日咳抗原的记忆T和B细胞以及IGG抗体。尽管百日咳疫苗是预防百日咳的有效手段，但疫苗接种后产生的免疫保护可能会随着时间减弱，这也是百日咳再次流行的一部分原因。因此，定期接种和增强接种对于保持免疫力至关重要
尽管百日咳疫苗是预防百日咳的有效手段，但aP疫苗诱导的血清抗体水平和临床保护在免疫接种后迅速下降。与aP疫苗相关的免疫减退被认为至少部分导致了接种人群中百日咳的再次出现，凸显了对新疫苗接种策略的需求以及对持续疫苗诱导免疫机制的改进理解的重要性。
研究目的
Objectives
疫苗接种后的免疫应答质量和强度取决于疫苗成分与先天免疫系统的相互作用。通过系统生物学方法，可以量化早期免疫过程并预测长达一年的体液免疫反应。不同疫苗针对不同传染性病原体时，可能引起不同的转录和细胞反应。对于百日咳，人类中的自然免疫反应尚未完全确定。因此，对含有aP的疫苗进行系统生物学分析有助于了解持久体液免疫反应机制以及先天免疫系统如何感知这类疫苗。本研究揭示了持久体液反应的早期相关性，提供了对aP疫苗的宿主分子免疫反应的见解，并揭示了以往未被认识的IPV作用。
研究方法
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研究亮点
1、多中心研究设计：跨国多中心研究，包括英国、芬兰和荷兰，对Tdap-IPV疫苗接种后的免疫应答进行全面评估。
2、血清学抗体分析：通过荧光珠多重免疫分析测定PT、FHA、Prn、TT和Dt特异性IgG抗体浓度，以及针对Polio.I、Polio.II和Polio.III的特异性IgG抗体浓度。
3、细胞分析：通过质谱细胞学分析，对主要免疫细胞系进行手动筛选，进行细胞亚群分析，测量细胞丰度和细胞内细胞因子产生。
4、RNA测序分析：对接种前（D0）和接种后（D1）的全血样本进行差异基因表达分析，使用DESeq2软件进行数据处理。
5、单细胞RNA测序：通过整合FACS标记和单细胞基因表达数据，使用多组学因子分析（MOFA）定义抗原呈递细胞亚群。
6、统计分析：采用线性混合效应模型等方法，对抗体浓度、细胞丰度和细胞因子产生进行统计分析，使用Wilcoxon检验等方法进行数据处理。
研究发现
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1、Tdap-IPV疫苗接种引发先天免疫激活和抗病毒反应
通过血液基因表达特征的量化，研究了Tdap-IPV疫苗接种的早期免疫反应。性别和接种背景在基因表达模式上的差异主要反映在性别间的分离上。疫苗接种后，参与者在基因表达和抗体反应上表现出相似性，不再按性别或接种背景分离。两队研究发现了大量差异表达基因，并通过基因集富集分析揭示了Tdap-IPV疫苗对多条免疫通路的影响，包括单核细胞、抗原呈递、树突状细胞激活和炎症反应。抗病毒免疫和干扰素反应通路在两队中显著富集。此外，接种后1天，两队均显示出中性粒细胞基因表达增强和NK细胞基因表达减少。UK队在特定转录模块上富集了浆细胞、B细胞以及多条T细胞激活和分化通路(图1)。
图1：A：荷兰（NL，左侧）和英国（UK，右侧）队参与者的全血RNA测序数据的主成分分析。显示样本时间点、性别和接种背景，以及每个成分解释的方差部分。线连接参与者接种前（D0）和接种后1天（D1）的样本。缩写：F女性，M男性，aP无细胞百日咳疫苗，wP全细胞百日咳疫苗。B：血液转录模块（BTMs）在Tdap-IPV疫苗接种后1天富集（FDR
2、早期基因特征与 Tdap-IPV 抗体反应相关
研究发现，接种后基因表达的变化与个体间体液免疫反应的差异相关，尤其是B细胞反应在英国队中与抗体诱导呈正相关，而荷兰队中与先天免疫BTMs高度相关。研究还揭示了与脊髓灰质炎病毒血清型相关的分子特征。通过对所有参与者进行相关性和BTM富集分析，发现干扰素和抗病毒感知、单核细胞、DC激活以及炎症反应的BTMs与接种后1年的百日咳特异性抗体反应相关。研究结果显示，包括抗病毒反应在内的先天免疫激活在接种后1天至1年内与Tdap-IPV疫苗的抗体反应相关(图2)。
图2：与 Tdap-IPV 诱发的调整对数倍数变化抗体反应相关的分子特征。血液转录模块（BTMs，行）的点图，显示接种后1天（第1天/第0天）的活性与Tdap-IPV诱导的特异抗体反应（列）在接种后28天（第28天/第0天）或1年（第1年/第0天）的调整对数折叠变化（方法）相关。数据显示了荷兰（NL，来自N=13参与者的26对样本）和英国（UK，来自N=11参与者的22对样本）队的合并参与者。基因集富集分析用于识别在预先排名的基因列表中BTMs的正（红色）或负（蓝色）富集，其中基因根据其基因表达与抗体反应之间的相关性进行排序。统计显著性和p值根据经验空值分布进行计算，反映双侧检验。假发现率（FDR）调整后的p值已计算。显示的BTMs（名义p值
3、Tdap-IPV疫苗接种在单核细胞和树突状细胞中诱导了I型干扰素和促炎细胞因子的产生。
全血基因表达分析揭示了疫苗诱导的先天免疫特征，与单核细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞相关。单核细胞和树突状细胞激活的基因模式与疫苗抗原1年后的抗体反应密切相关。研究通过大质谱检验探究了这些发现是否与细胞数量和/或激活状态的变化有关。接种后1天，循环白细胞数量显著增加，T细胞减少，粒细胞和单核细胞显著增加。详细分析了多个抗原呈递细胞亚群，显示出不同的细胞数量和促炎细胞因子产生。总体而言，Tdap-IPV疫苗引发早期免疫反应，包括T细胞和树突状细胞的外流，伴随着单核细胞和树突状细胞中的促炎细胞因子和干扰素的诱导(图3)。
图3: Tdap-IPV 疫苗接种可诱导经典单核细胞、浆细胞和经典 DC2 细胞产生干扰素和炎症细胞因子。在对基线（D0）和接种后第1天（D1）的血液样本进行聚类和手动合并类似聚类之后，确定了八个抗原呈递细胞亚群（附加信息，图S11）。每个亚群的标准化表型蛋白标记表达值的点图显示在左边缘。UMAP可视化显示了所有亚群，其中用虚线框标示了对疫苗作出反应的亚群。显示了经典DC2细胞、浆细胞样DC和经典单核细胞的数量变化（显示血液中细胞数的箱线图）和细胞因子产生（显示平均信号强度的箱线图）。数据来自荷兰队中12名参与者的24个样本，（C）、（D）和（E）的数据点代表每个样本的值，同一参与者的数据点由灰线连接。箱线图显示了从第25到第75百分位数的边界，中位线和触须，触须延伸到最大或最小值不超过1.5倍四分位距。白色填充的箱线图对应于D0样本，灰色填充的箱线图对应于D1样本。针对每个反应（数量或细胞因子），从混合效应回归模型中计算了统计显著性（经过虚发现率（FDR）调整的双侧p值），并指定了研究日和参与者编号为固定和随机效应，分别为* FDR 0.05。
4、Tdap-IPV疫苗在单核细胞和树突状细胞中诱导抗病毒基因表达。
通过单细胞RNA测序确定个体APC亚群的转录变化，并发现抗病毒和干扰素反应在整体血液中的转录反应中占主导地位。疫苗接种后，各APC亚群显示明显的转录变化，尤其是DC2细胞。GO分析显示抗病毒和干扰素反应是主要富集的生物过程，同时细胞因子反应和TLR信号传导也显著富集。与整体血液生物标志物的变化相关的基因主要与cMo、ncMo和DC2亚群的表达相关，揭示了疫苗接种后APC亚群内部的转录变化对整体免疫应答的重要性(图4)。
图4：单细胞RNA测序揭示了抗原呈递细胞中的I型干扰素和抗病毒基因表达。对荷兰队7名参与者的14份血液样本（涵盖D1和D0两个时间点，共6348个单细胞）进行UMAP可视化，根据亚群着色，并显示了蛋白标记的点图和顶部区分基因的RNA表达谱。接种后1天上调的差异表达基因（DEGs）用黑色边框标记，如果名义p值0，FDR
5、灭活脊髓灰质炎病毒刺激单核细胞和树突状细胞中的p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导
研究表明，灭活脊髓灰质炎病毒刺激单核细胞和树突状细胞中的p38-MAPK信号传导。Tdap-IPV疫苗可能通过激活这些细胞来引发早期抗病毒反应。实验比较了含有或不含IPV的疫苗在体外诱导的细胞内信号差异，结果显示IPV可引发更强的磷酸化反应。研究还暗示内体TLR对于引导Tdap-IPV疫苗成分的炎症反应可能起着重要作用(图5)。
图5：灭活脊髓灰质病毒刺激经典单核细胞和树突状细胞中的P38和MAPK磷酸化信号反应。
A. 用于分析疫苗刺激后磷酸化信号反应的实验计划。来自健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）未经刺激或与所示刺激物之一孵育15分钟。随后使用质谱细胞术识别先天免疫细胞群，并量化磷酸化信号反应。
B. 在Tdap、Tdap-IPV或IPV刺激后，细胞中表达磷酸化p38（pp38）或MAPKAPK2（pMAPKAPK2）的比例。显示了五种抗原呈递细胞亚群的反应。数据为N = 5名健康供体。经典单核细胞（pMAPKAPK2）：TdapIPV vs Tdap p = 0.023；IPV vs Tdap p = 1.98 × 10^(-5)；TdapIPV vs IPV p = 0.001；IPV vs TdapIPV p = 0.001。经典单核细胞（pp38）：TdapIPV vs Tdap p = 0.009；IPV vs Tdap p = 2.41 × 10^(-5)；IPV vs TdapIPV p = 0.016。经典树突状细胞（pMAPKAPK2）：TdapIPV vs Tdap p = 0.039；IPV vs Tdap p = 0.004；经典树突状细胞（pp38）：IPV vs Tdap p = 0.011；TdapIPV vs Tdap p = 0.045；中间单核细胞（pMAPKAPK2）：IPV vs Tdap p = 0.03；中间单核细胞（pp38）：IPV vs Tdap p = 0.002；非经典单核细胞（pp38）：TdapIPV vs Tdap p = 0.02。
C. 在第二个实验中，PBMCs预先用巴非洛霉素孵育或未处理，并随后受到所示疫苗的刺激。显示了经典单核细胞中pp38和pMAPKAPK2的表达。数据为N = 6名健康供体。经典单核细胞（pMAPKAPK2）：TdapIPV.Bafilomycin vs TdapIPV.Untreated p = 0.012，IPV.Bafilomycin vs IPV.Untreated p = 0.036，Tdap.Bafilomycin vs Tdap.Untreated p = 0.15，TdapIPV.Untreated vs Tdap.Untreated p = 0.02，IPV.Untreated vs Tdap.Untreated p = 0.0002，IPV.Untreated vs TdapIPV.Untreated p = 0.0046；经典单核细胞（pp38）：TdapIPV.Bafilomycin vs TdapIPV.Untreated p = 0.007，IPV.Bafilomycin vs IPV.Untreated p = 0.040，Tdap.Bafilomycin vs Tdap.Untreated p = 0.73；TdapIPV.Untreated vs Tdap.Untreated p = 0.004，IPV.Untreated vs Tdap.Untreated p = 0.0002，IPV.Untreated vs TdapIPV.Untreated p = 0.008。* P
6、Tdap-IPV疫苗引起的抗病毒反应比Tdap疫苗更强
研究结果表明，含有IPV的疫苗诱导了更高水平的抗病毒、干扰素和单核细胞、树突状细胞反应，与Tdap疫苗相比。这表明Tdap-IPV疫苗中IPV的存在会增强免疫反应(图6)。
图6：与 Tdap 相比，Tdap-IPV 可诱导更强的抗病毒基因表达。
A. 一种比较Tdap和Tdap-IPV疫苗接种效果的方法。
B. 对一个基因列表进行基因集富集分析（GSEA），该列表按照Tdap-IPV（合并NL和UK队列）和Tdap疫苗接种（Antunes队列）之间的对数折叠变化差异（D1/D0）进行排名。显示了显著富集（FDR
C. 显示了从（B）中选择的BTMs的基因，以及Tdap-IPV（合并NL和UK队列）和Tdap疫苗的对数折叠表达（D1/D0）。差异表达基因（DEG，FDR 0.5）用星号标记。统计学显著性通过负二项式线性模型计算，并计算了FDR调整的双侧p值。
D. 显示了与调整后的PT特异性抗体反应的对数折叠变化相关的选定BTMs（行）的点图，该反应在Tdap接种后第1天（D1/D0）与Tdap接种后第30天（Day 30/Day 0）或第90天（D90/Day 0）相关。数据为Tdap队列的N = 32名参与者。使用GSEA识别基因列表中BTMs的正（红色）或负（蓝色）富集，其中基因根据它们的基因表达与抗体反应之间的相关性进行排序。与Tdap-IPV接种后抗体反应相关的选定BTMs（与图3相关）标记在y轴上，并显示了这些BTMs与Tdap诱导的PT抗体反应的显著相关性（名义p
研究讨论
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研究创新性
该研究采用系统疫苗学方法，旨在识别青少年早期抗体反应的相关因素，并描述了Tdap-IPV疫苗后的先天免疫反应。研究结果显示，Tdap-IPV疫苗引发的抗病毒反应与抗体诱导高度相关，表明该疫苗在免疫学上更类似于病毒疫苗而非细菌疫苗。此外，研究结果还指出IPV在aP疫苗中的存在可能增强了免疫反应，促进了抗体应答，为疫苗辅助剂的作用提供了新的见解。
研究局限性
本研究不是随机临床试验，因此无法直接验证IPV是否增强百日咳疫苗的免疫原性。另外，研究结果显示英国和荷兰队列之间的抗体反应存在差异，可能与基线百日咳特异性记忆细胞的差异有关。此外，由于未测量百日咳特异性T细胞免疫，性别对百日咳疫苗反应的影响也未得到全面调查。综合而言，尽管该研究为我们理解Tdap-IPV疫苗的免疫学效应提供了重要见解，但仍需要进一步研究以验证其作用机制和临床应用的可行性。
参考文献
[1] Gillard, J., Suffiotti, M., Brazda, P. et al. Antiviral responses induced by Tdap-IPV vaccination are associated with persistent humoral immunity to Bordetella pertussis. Nat Commun 15, 2133 (2024).https://doi.org/10.1038/s41467-024-46560-w
END
文案 | Alison
排版 | Alison
审核 | Alison
发布｜姜笑南
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