近日，我院脑病中心神经内科邱伟团队联合香港中文大学刘晓东团队在国际期刊Nature Communications（中科院一区）发表题为 “Astrocyte Derived Clusterin Disrupts Glial Physiology to Obstruct Remyelination in Mouse Models of Demyelinating Diseases”的研究论文。我院脑病中心陈晨博士，神经内科舒崖清副教授、言诚开博士后为共同第一作者；我院脑病中心神经内科邱伟教授、秦峰主任医师，香港中文大学刘晓东教授为共同通讯作者。该研究得到了陆军军医大学梅峰、海南省人民医院黄仕雄、广东三九脑科医院王展航等专家的支持。
研究背景
多发性硬化（MS）是西方人群最为常见的神经系统疾病之一（>1/10000患病率），而东方人群相对少见（
MS目前无治愈方法，治疗主要集中在免疫调节领域，但仍不能有效阻断疾病进展。近年，中枢神经系统内不同胶质细胞相互作用成为研究热点，它也可能是影响MS患者OPC分化的关键因素之一。因此，该研究探讨MS患者胶质细胞间相互作用的机制，从而开发新的MS治疗靶点。
研究概述
1、临床数据显示CLU在MS患者及动物模型脑组织中表达
MS患者标本结合已公开发表的测序数据显示，星形胶质细胞（AST）在活跃的病灶区域呈现显著的Clusterin（CLU）高表达。免疫荧光揭示，CLU主要与GFAP+AST细胞共定位，且在活动性病灶区域。另外，在MS的实验模型EAE中，小胶质细胞（IBA1+）、少突胶质细胞前体（OPC，PDGFRa+）、成熟少突胶质细胞（CC1+）、神经元（NeuN+）以及血管内皮细胞（CD31+）中均未检测到CLU表达信号。同时，在EAE模型和LPC诱导的脱髓鞘模型的病灶中，也观察到AST细胞CLU表达上调。最后，EAE中CLU表达水平与EAE残疾评分存在显著相关。然而，在铜腙诱导的非炎症脱髓鞘模型中，并未出现CLU表达上调（图1、图2）。证明，CLU仅在“炎性”脱髓鞘环境下，且仅在AST细胞的特异性表达。
△图1 CLU在MS和小鼠EAE模型中的星形胶质细胞中表达水平升高
△图2 单细胞测序分析提示CLU在多发性硬化患者病灶中AST细胞中高表达
2、CLU可抑制星形胶质细胞吞噬髓鞘碎片功能
通过RNAseq，研究人员探究了CLU对AST细胞增殖和功能影响。利用体外EDU增殖实验，研究人员成功验证了CLU对AST细胞增殖的促进作用。体内缓释泵实验进一步证实，CLU在小鼠中枢神经系统能显著增强GFAP+ALDH1L1+AST细胞的增殖能力。另一方面，髓鞘吞噬实验证明，CLU可抑制AST细胞的髓鞘吞噬功能。然而，对于另一类髓鞘碎片清除细胞——小胶质细胞，CLU对其吞噬功能无明显影响（图3）。因此，CLU在神经系统中对AST起重要作用。
△图3 CLU对星形胶质细胞和小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的影响
3、CLU可损伤少突胶质细胞及其前体OPC细胞并导致髓鞘缺失
通过RNAseq，研究人员对CLU刺激下少突胶质前体细胞（OPC）进行测序分析。结果显示，CLU在短时间内（3h）即可显著下调与OPC分化及髓鞘形成紧密相关的基因表达。GSEA中的GO注释表明CLU对OPC的毒性作用，在“response to toxic substance”和“mitochondrial outer membrane permeabilization involved in programmed cell death”等过程中富集。在长时间（24h）刺激后，研究人员发现CLU暴露与Pi3k-Akt信号通路抑制紧密相关。因此，CLU对OPC有作用，不仅导致其增殖和分化过程出现障碍，还能对其细胞功能造成损害。研究人员进一步行体外刺激实验，证实CLU会导致OPC的分化与成熟异常，同时观察到其增殖能力下降和凋亡率上升。
在器官型脑片实验中，研究人员也观察到相同结果，证实CLU的负面效应。基于NG2-CreERT2:: taumGFP报告小鼠的实验模型，研究人员观察到外源性CLU的持续泵入会导致GFP+新生髓鞘减少，以及髓鞘厚度的显著降低。此外，当研究人员在AST细胞中特异性过表达CLU（利用Cre-DIO系统）时，也观察到相同结果，包括NG2+ OPC和CC1+少突胶质细胞数量的减少，以及CC3+凋亡细胞比例增加。电镜也显示局部髓鞘厚度变化。综上所述，在病理状态下，AST细胞所分泌的CLU会对少突胶质细胞及其前体细胞造成损伤。然而，CLU对神经轴索并未产生显著影响（图4-7）。
△图4 RNAseq显示CLU对OPC转录水平的影响
△图5 CLU在体外对少突胶质细胞及其前体细胞的影响
△图6 不同时间点CLU在体外对于少突胶质细胞及其前体细胞的影响
△图7 NG2-CreERT2:: taumGFP报告小鼠及CLU特异性过表达系统(Cre-DIO)提示星形胶质细胞所分泌的CLU对少突胶质细胞及其前体细胞造成损伤
4、CLU对少突胶质细胞及其前体OPC细胞的损伤由VLDLR介导
通过对不同年龄阶段小鼠大脑的研究，研究人员发现少突胶质细胞及其前体OPC细胞持续稳定地表达VLDLR，而AST细胞则主要表达ApoER2受体。此外，在EAE和LPC脱髓鞘模型中，这些受体依然存在持续表达。因此，VLDLR在CLU诱导的OPC损伤中扮演核心角色。研究人员进一步采用NG2启动子慢病毒介导的特异性敲低技术，针对NG2+ OPC细胞中的VLDLR进行敲低操作。结果表明，VLDLR敲低后，OPC中的EDU+细胞比例显著增加，而CC3+细胞比例显著降低。因此，VLDLR的减少可以有效缓解CLU对OPC的损伤作用（图8-9）。
△图8 少突胶质细胞及其前体细胞在不同年龄段与不同模型中的VLDLR表达情况
△图9 利用慢病毒特异性敲低NG2+ OPC细胞VLDLR后可减轻CLU对OPC细胞的损伤
5、Pi3k-Akt通路是CLU诱导OPC损伤的重要机制
在体外实验中，研究人员通过测序揭示了CLU对Pi3k-Akt通路的抑制作用。随后，研究人员采用缓释泵系统为外源性CLU暴露小鼠分别注射了Akt激动剂SC79与拮抗剂MK2206，并观察到了显著的生物学效应。具体而言，SC79能够部分逆转由CLU暴露引起的NG2+/CC1+细胞数量减少，同时降低了CC3+细胞比例；MK2206则加剧CLU对NG2+ OPC细胞及CC1+少突胶质细胞的损害。因此，CLU通过抑制Pi3k-Akt通路，导致了少突胶质细胞及OPC细胞的损伤（图10）。
△图10 CLU通过抑制Pi3k-Akt通路导致少突胶质细胞及其前体细胞损伤
6、CLU敲低与敲除可提高小鼠脱髓鞘病灶的髓鞘修复
利用携带shCLU的AAV，研究人员成功地敲低了小鼠胼胝体区的CLU表达，另外借助GfaABC1D启动子的AAV-Cre-EGFP特异性地敲除了CLUfl/fl小鼠胼胝体区AST细胞的CLU。随后，对这些小鼠行LPC脱髓鞘模型，结果显示CLU敲低与敲除显著提高了LPC脱髓鞘病灶区域内OPC和OL细胞数量和髓鞘厚度。结果提示局部CLU表达的敲除对于LPC脱髓鞘病灶的髓鞘再生具有显著的促进作用。研究人员进一步构建了ALDH1L1-CreERT::CLUfl/fl条件敲除小鼠，并对其进行EAE造模。结果显示，条件敲除小鼠相较于对照组表现出较低的疾病发病水平，且其脊髓病灶中的OPC的凋亡现象有所缓解。此外，敲除小鼠病灶中IBA1+小胶质细胞/巨噬细胞的数量显著减少，提示AST细胞上CLU的敲除可能具有髓鞘保护效应（图11-14）。
△图11 CLU敲低可增强LPC导致的胼胝体脱髓鞘病灶的髓鞘再生
△图12 敲低CLU可促进LPC脱髓鞘病灶的髓鞘修复
△图13 敲除星形胶质细胞CLU可减轻EAE发病程度及病灶内少突胶质前体细胞的损伤
△图14 敲除星形胶质细胞的CLU可促进LPC脱髓鞘病灶的髓鞘修复，减轻EAE脱髓鞘病灶中IBA1+细胞数量
研究意义
本研究揭示了，星型胶质细胞在病理免疫状态下（如MS/EAE）促进CLU分子表达，CLU通过作用于OPC细胞上的VLDLR受体，抑制Pi3k-Akt通路，最终损伤OPC细胞和阻碍髓鞘再生的关键机制。同时，该研究阐明了，MS中髓鞘损伤及再生受阻的新机制，为MS预后判断提供了新的生物标记物，同时为MS治疗提供了全新的靶点和方向。
△图15 MS/EAE中星胶“发炎”，抑制髓鞘再生
研究团队
通讯作者
第一作者
我院脑病中心神经内科邱伟、舒崖清、汤常永团队近年来一直致力于神经免疫病中不同胶质细胞的功能互作及其靶向治疗策略 （图16）。团队近期在Nature Communications（2024）、Cell Reports（2024a，2024b）、Science Advances（2023）、Molecular Therapy（2023）、ACS Nano（2022）、Glia（2022）、Clinical and Translational Medicine（2022）、Neurobiology of Disease（2024）、Molecular Neurobiology（2023）、Neuroscience Bulletin（2019）等国际期刊发表系列原创性神经免疫病论文。本研究在星型胶质细胞功能机制上，取得了新的进展，为神经免疫病的机制研究提供了新思路。
△图16 神经免疫病胶质细胞互作研究总结图
