阿尔茨海默症（Alzheimer's Disease, AD）是21世纪主要的健康挑战之一，也是导致痴呆的主要原因。β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集是AD的显著特征之一。Aβ肽由淀粉样前体蛋白（APP）通过蛋白水解裂解产生，APP的不正常裂解被认为是AD进展的启动因素。在健康个体中，Aβ的产生与清除保持平衡，而在AD患者中，这一平衡被打破，导致Aβ斑块在大脑中积累，进而引发小胶质细胞的浸润和神经毒性。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻吞噬细胞，具有清除毒性蛋白斑块、细胞残骸、病原体及损伤或死亡细胞等多种功能。近年来，小胶质细胞在AD中的作用逐渐被认识到，尤其是在Aβ清除方面，其通过不同的受体结合，吞噬并清除Aβ。
近日，南方科技大学生命科学院的万峻/潘杰团队在Advanced Science杂志上发表了题为Microglial Lyzl4 Facilitates β-Amyloid Clearance in Alzheimer's Disease的文章。该研究揭示了溶菌酶家族在AD中具有保护作用，溶菌酶样蛋白Lyzl4的过表达可在体内外增强Aβ的清除能力，表明其可能通过调节Aβ清除减轻AD病理负担。这些发现揭示了Lyzl4在AD治疗中的潜力。
研究通过从不同年龄段（2、4、6、9和12月龄）的APP/PS1（AD模型）和野生型（WT）小鼠中分离原代小胶质细胞并进行bulk RNA测序，结合加权基因共表达网络分析（WGCNA），构建了基因共表达网络并识别了7个显著的基因模块。其中，ME3模块与AD进展和小鼠年龄呈显著正相关，进一步分析显示Lyzl4在模块成员关系和基因对AD的重要性上均排名靠前。通过qPCR和RNAscope原位杂交对WT和AD小鼠进行验证，显示Lyzl4在AD模型中随年龄显著上调，结果与测序结果一致。此外，在其他AD小鼠，APPSAAKI/KI敲入小鼠和tau模型小鼠 rTg4510小鼠中也观察到Lyzl4的显著上调。
Lyzl4是C型溶菌酶样家族中唯一在脑组织中表达的成员，而其家族的其他成员（Lyzl1、Lyzl3和Lyzl6）主要存在于生殖系统中，Lyzl4的组织特异性表达水平在生殖系统中最高，而在脑组织中的表达水平次之。序列分析显示，Lyzl4在不同物种间具有约60%的同源性，尽管其归类为溶菌酶样蛋白，但因催化结构域的突变和缺失（D52G突变和70-74位氨基酸缺失），其不具备溶菌酶活性。单细胞测序数据表明，Lyzl4主要在小胶质细胞和兴奋性神经元中表达。通过构建CMV-Lyzl4-EGFP质粒并在小胶质细胞系和原代小胶质细胞中进行活细胞成像，发现Lyzl4主要定位于小胶质细胞的溶酶体内。此外，通过不同浓度（1–4 µM）的Aβ1-42寡聚体（一种在AD脑中积累的神经毒性蛋白聚集体）刺激小胶质细胞（包括BV2细胞系和原代小胶质细胞），可显著诱导Lyzl4的表达上调。
通过构建高效的Lyzl4过表达慢病毒系统，实验显示，Lyzl4过表达不影响小胶质细胞整体的吞噬功能，但显著增强了对Aβ寡聚体的清除能力。同时，ELISA检测显示过表达细胞内Aβ浓度降低，而细胞外Aβ水平无显著变化，表明Lyzl4主要促进溶酶体内Aβ的降解（图1）。此外，通过siRNA敲低Lyzl4的实验表明，仅抑制Lyzl4不足以完全阻断Aβ清除，提示可能存在其他补偿机制。
图1: Lyzl4在原代小胶质细胞中的过表达增强了Aβ的清除能力，但不影响吞噬作用。(A-B) 对照组(A)和Lyzl4过表达组(B)原代小胶质细胞吞噬pH敏感绿色荧光标记微珠；
(C-D) 对照组(C)和Lyzl4过表达组(D)原代小胶质细胞吞噬pH敏感绿色荧光标记Aβ；
研究表明，Lyzl4在小胶质细胞中过表达可通过增强Aβ向晚期内涵体和溶酶体的运输和降解能力，在体内显著减少APP/PS1小鼠中的Aβ负担，同时降低促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-12）的水平，表明其在调控小胶质细胞炎症反应中的保护作用。使用小胶质特异性启动子驱动的AAV-Lyzl4病毒注射后，Aβ斑块面积减少但小胶质细胞数量未变化（图2），进一步通过共聚焦显微镜显示Aβ和Lyzl4主要与晚期内涵体（Rab7）和溶酶体（Lamp1）共定位，而与早期内涵体（EEA1）无明显共定位，表明Lyzl4主要通过内吞降解途径来清除Aβ。
图2：Lyzl4在体内促进小胶质细胞清除Aβ斑块，可能与大吞饮作用有关。(A-B) 在5月龄的APP/PS1小鼠的皮层双侧立体定向注射标记的AAV-NC或AAV-Lyzl4;
(C-D) 小胶质细胞标志物Iba1（橙色）、Aβ（绿色）和细胞核（DAPI，蓝色）在AAV-Lyzl4半球（C）和AAV-NC半球（D）的代表性荧光显微镜图像;
(E) AAV-NC与AAV-Lyzl4小鼠中感兴趣区域（ROI）中的斑块数量，在注射后1个月进行评估;
(F) AAV-NC与AAV-Lyzl4小鼠的感兴趣区域（ROI）中，每个斑块相关的小胶质细胞数量，在注射后1个月进行评估;
(G) 在AAV-NC与AAV-Lyzl4小鼠的皮质组织中，通过ELISA测量的标准化Aβ水平;
(H) FACS流式细胞分选小胶质细胞;
(I) 在分离的小胶质细胞中测量TNF-α、IL-1β和IL-12的标准化表达水平。
本研究通过转录组分析、基因分析、体外成像及立体定位注射等方法，揭示Aβ刺激可诱导小胶质细胞从静息状态转变为伴随Lyzl4上调的激活状态，而Lyzl4的过表达能够增强小胶质细胞清除Aβ的能力，主要通过促进其内吞后向晚期内涵体及溶酶体的运输。尽管Lyzl4敲低后未观察到显著的Aβ清除差异，但可能存在其他补偿性途径。Aβ在小胶质细胞中的清除以流体相吞饮为主，受胞吞小管和相关基因调控。Lyzl4在AD相关小胶质细胞激活模块中处于关键位置，与炎症和应激反应密切相关。通过Lyzl4-AAV治疗APP/PS1小鼠显著减少了Aβ斑块，但未完全清除，可能与Lyzl4水平不足或其他细胞类型参与有关。未来需结合行为学研究及深入分子机制探索，进一步验证Lyzl4在Aβ清除及AD治疗中的潜力。
